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科研試驗(yàn)時(shí)的蛋白酶K樣本處理

更新日期: 2023-07-26
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動(dòng)物內(nèi)臟、肌肉組織、血液以及培養(yǎng)的細(xì)胞和細(xì)菌等樣本在裂解液和蛋白酶K的作用下破碎并可使大部分蛋白質(zhì)變性,釋放出基因組DNA。在其所提供的合適的鹽離子和pH環(huán)境的作用下,與乙醇混合后,基因組DNA特異性地結(jié)合于膜上,大部分蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)在兩次洗滌過(guò)程中被洗下,而DNA與膜結(jié)合牢固,在洗脫液的作用下被洗下。
樣本處理:
(1)全血:
a)如果全血體積大于200μL,請(qǐng)先使用紅細(xì)胞裂解液或淋巴細(xì)胞分離液收集細(xì)胞,然后用200μL PBS緩沖液或生理鹽水充分重懸,進(jìn)行步驟2。
b)如果樣本不足200μL,可以加入適量的PBS緩沖液或者生理鹽水補(bǔ)足200μL,進(jìn)行步驟2。
c)從人血液中提取DNA的方法與從哺乳動(dòng)物血液中提取DNA的方法相同。
d)從鳥類血液中提取的DNA需將不多于20μL血液樣本,加PBS緩沖液至200μL,混合后開始提取,進(jìn)行步驟2。
(2)組織樣本:
每份組織分別從不同的三個(gè)位置稱取1g,用手術(shù)剪剪碎混勻后取約50mg置于研磨器中,加入0.5mL-1mL生理鹽水研磨,勻漿后轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌的離心管,8000rpm離心2分鐘,取上清200μL加入1.5mL離心管,進(jìn)行步驟2。
(3)培養(yǎng)的細(xì)胞:
懸浮細(xì)胞:細(xì)胞培養(yǎng)液3000rpm離心2分鐘,去上清,收集2×106個(gè)細(xì)胞(容積200μL),轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管,進(jìn)行步驟2。
貼壁細(xì)胞:去上清,收集2×106個(gè)細(xì)胞(容積200μL),轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管,進(jìn)行步驟2。
(4)其他液體樣本:
1000rpm離心2分鐘 ,棄上清,收集沉淀,進(jìn)行步驟2。
(5)菌液:
培養(yǎng)的菌液,5000rpm離心1分鐘,棄上清,收集至少2×106個(gè)細(xì)菌,進(jìn)行步驟2。
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